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兩步發(fā)酵法的第一步，先用根霉將糖類發(fā)酵生成富馬酸，即富馬酸發(fā)酵，這里的糖較多的使用葡萄糖，葡萄糖可由淀粉經(jīng)雙酶水解而得。

第二步是在前面所產(chǎn)的富馬酸中接入酵母菌或細菌進行發(fā)酵，將富馬酸轉化為L-蘋果酸，即轉化發(fā)酵。采用這種方法，蘋果酸對糖轉化率最高可達60%以上，但是畢竟發(fā)酵周期太長，前后加起來要8～9天。雖然兩步法與一步法一樣，國內外學者正在不斷地探索，取得了一些有價值的進展，但至今仍然未見工業(yè)化生產(chǎn)的報道。 無論是一步法還是兩步法發(fā)酵，如以淀粉為原料，在使用前都需進行水解處理，使之成為葡萄糖，而淀粉的水解方法是雙酶水解法。

目前，國內外L-蘋果酸工業(yè)化生產(chǎn)的方法，都是固定化細胞轉化法。該方法是首先大量培養(yǎng)富馬酸酶活力高的菌體，收集菌體后用卡拉膠等適當?shù)妮d體進行固定，然后裝入柱式反應器，以富馬酸鈉鹽為底物，流經(jīng)反應器，由固定化細胞中的富馬酸酶的催化作用，很容易將富馬酸轉化為L-蘋果酸，且?guī)缀鯚o副產(chǎn)物，轉化率高達95%以上。此法與上述兩種方法相比，簡單、 經(jīng)濟、高效，于是成了工業(yè)化生產(chǎn)的首先方法。